Moleküler Biyoloji ve Genetik Doktora Programı / Molecular Biology and Genetics PHD Program

Permanent URI for this collectionhttps://hdl.handle.net/11413/6625

Browse

Browsing Moleküler Biyoloji ve Genetik Doktora Programı / Molecular Biology and Genetics PHD Program by Author "ŞAHİN, BURCU AYHAN"

Filter results by typing the first few letters
Now showing 1 - 1 of 1
  • Thumbnail Image
    PublicationOpen Access
    Büyüme hormonu salgılatıcı hormona [GHRH (1-44)] özgü X-aptamerlerin sentezlenmesi, karakterizasyonu ve anti-karsinojenik etkilerinin araştırılması
    (İstanbul Kültür Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı, 2021) ŞAHİN, BURCU AYHAN; Gürkan, Ajda Çoker
    Büyüme Hormonu Salgılatıcı Hormon (GHRH), hipotalamustan salınan bir nöropeptittir ve farklı kanser türlerinde ekspresyonunda artış olduğu literatürde ortaya koyulmuştur. Bu artan ekspresyonun bloke edilmesi amacıyla çeşitli peptid antagonistleri sentezlenmiş ve bu antagonistlerin anti-kanser etkisi çeşitli kanser tiplerinde in vitro ve in vivo olarak gösterilmiştir. Bu kapsamda, GHRH sinyalinin bloke edilmesi, çeşitli kanser tiplerinde önemli bir terapötik yaklaşım olarak karşımıza çıkmaktadır. Aptamerler, yüksek özgünlükle hedef moleküllere bağlanabilen tek iplikli oligonükleotidlerdir ve ilaç taşıyıcılığı, görüntüleme, deteksiyon, yeni ilaç geliştirilmesi gibi farklı amaçlarla kullanılabilmektedir. Aptamerler geleneksel olarak SELEX adı verilen bir yöntemle seçilmekle birlikte, hedefe bağlanma afinitesinin ve nükleazlara karşı stabilitesinin arttırıldığı manyetik boncuk tabanlı farklı yöntemlerle de elde edilebilmektedir. Bu yöntemlerden bir tanesi olan x-aptamer seçilimi, patentli bir teknik olup modifiye edilmiş nükleotitler içermekte ve bu sayede hedef moleküle bağlanma afinitesi daha yüksek ve nükleazlara karşı stabilitesi daha yüksek olan x-aptamerlerin seçilimi mümkün olmaktadır. Bu tez çalışmasında, GHRH (1-44)'e özgü x-aptamerlerin sentezlenmesi, karakterizasyonu ve GHRH sinyalini bloke ederek çeşitli kanser hücrelerindeki anti-karsinojenik etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, GHRH gen bölgesini taşıyan plazmidleri içeren prokaryotik E. coli ve ökaryotik HEK293 hücrelerinden elde edilen GHRH proteini hedef olarak kullanılarak, manyetik boncuk teknolojisi yardımıyla x-aptamer seçilimi gerçekleştirilmiş ve 19 adet putatif x-aptamer elde edilmiştir. Elde edilen x-aptamerlerin rekombinant GHRH proteinine bağlanma afiniteleri Dot blot yöntemi ile araştırılmış ve aptamer uygulaması ile proteine bağlanma afinitesinin 1,5 ila 4 kata kadar arttığı belirlenmiştir. Ayrıca aptamer dozuna bağlı gerçekleştirilen Dot blot yöntemi sonucunda non-lineer regresyon analizi yapılarak aptamerlerin disosiasyon sabiti (Kd) değerleri hesaplanmıştır. TKY2.T1.13 aptameri ile gerçekleştirilen SPR analizi sonucunda bu aptamer için Kd değeri 47,5 nM olarak tespit edilmiş ve non-lineer regresyon analizi ile elde edilen 57,5 nM Kd değerine yakın bir değer olarak gösterilmiştir. Aptamerler süreye bağlı olarak insan serumu ile muamele edilerek aptamerlerin serum stabiliteleri araştırılmış ve aptamerlerin çoğunlukla 72 saate kadar insan serumunda %50'nin üzerinde stabil kaldığı belirlenmiştir. TKY2.T1.08 ve TKY2.T1.13 aptamerlerinin hücre içerisinde yer alan endojen GHRH'ye doza bağlı olarak artan bağlanma afinitesi MIA PaCa-2 hücrelerinde immunofloresan yöntemi ile gösterilmiştir. Putatif x-aptamerlerin GHRH sinyal yolağına etkisinin araştırılması için aşağı yolak elemanları olan GH ve GHRH-R ekspresyonuna etkileri immunofloresan yöntemi ile gösterilmiş ve aptamer uygulaması ile bu proteinlerin ekspresyonlarındaki azalma gösterilmiştir. Ayrıca, TKY2.T1.08 ve TKY2.T1.13 x-aptamerlerinin MIA PaCa-2 pankreas, HT29 kolorektal ve PC3 prostat kanseri hücrelerinde hücre canlılığına ket vurduğu ve mitokondriyal membran potansiyelini düşürdüğü belirlenmiştir. Putatif x-aptamerlerin hücre döngüsü üzerine etkileri araştırıldığında ise TKY2.T1.13 aptamerinin MIA PaCa-2, HT29 ve PC3 hücrelerinde SubG1 populasyonunu arttırdığı, TKY2.T1.08 aptamerinin ise HT29 ve PC3 hücrelerinde G2/M populasyonunu arttırdığı gösterilmiştir. Putatif x-aptamerlerin hücre ölümü üzerine etkileri Annexin V/PI hücre akış sitometrisi yöntemi ile araştırılmış ve TKY2.T1.13 x-aptamerinin MIA PaCa-2, HT29 ve PC3 hücrelerinde geç apoptotik hücre populasyonunda artışa neden olduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak, bu tez çalışması kapsamında GHRH (1-44) proteinine özgü x-aptamer sentezi ilk kez gerçekleştirilmiş, sentezlenen x-aptamerlerin hedef proteine bağlanma afiniteleri gösterilmiş ve GHRH sinyal yolağına ket vurarak antikarsinojenik etkileri MIA PaCa-2, HT29 ve PC3 hücrelerinde gösterilmiştir.