Moleküler Biyoloji ve Genetik Doktora Programı / Molecular Biology and Genetics PHD Program

Permanent URI for this collectionhttps://hdl.handle.net/11413/6625

Browse

Recent Submissions

Now showing 1 - 2 of 2
  • Thumbnail Image
    PublicationOpen Access
    Büyüme hormonu salgılatıcı hormona [GHRH (1-44)] özgü X-aptamerlerin sentezlenmesi, karakterizasyonu ve anti-karsinojenik etkilerinin araştırılması
    (İstanbul Kültür Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı, 2021) ŞAHİN, BURCU AYHAN; Gürkan, Ajda Çoker
    Büyüme Hormonu Salgılatıcı Hormon (GHRH), hipotalamustan salınan bir nöropeptittir ve farklı kanser türlerinde ekspresyonunda artış olduğu literatürde ortaya koyulmuştur. Bu artan ekspresyonun bloke edilmesi amacıyla çeşitli peptid antagonistleri sentezlenmiş ve bu antagonistlerin anti-kanser etkisi çeşitli kanser tiplerinde in vitro ve in vivo olarak gösterilmiştir. Bu kapsamda, GHRH sinyalinin bloke edilmesi, çeşitli kanser tiplerinde önemli bir terapötik yaklaşım olarak karşımıza çıkmaktadır. Aptamerler, yüksek özgünlükle hedef moleküllere bağlanabilen tek iplikli oligonükleotidlerdir ve ilaç taşıyıcılığı, görüntüleme, deteksiyon, yeni ilaç geliştirilmesi gibi farklı amaçlarla kullanılabilmektedir. Aptamerler geleneksel olarak SELEX adı verilen bir yöntemle seçilmekle birlikte, hedefe bağlanma afinitesinin ve nükleazlara karşı stabilitesinin arttırıldığı manyetik boncuk tabanlı farklı yöntemlerle de elde edilebilmektedir. Bu yöntemlerden bir tanesi olan x-aptamer seçilimi, patentli bir teknik olup modifiye edilmiş nükleotitler içermekte ve bu sayede hedef moleküle bağlanma afinitesi daha yüksek ve nükleazlara karşı stabilitesi daha yüksek olan x-aptamerlerin seçilimi mümkün olmaktadır. Bu tez çalışmasında, GHRH (1-44)'e özgü x-aptamerlerin sentezlenmesi, karakterizasyonu ve GHRH sinyalini bloke ederek çeşitli kanser hücrelerindeki anti-karsinojenik etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, GHRH gen bölgesini taşıyan plazmidleri içeren prokaryotik E. coli ve ökaryotik HEK293 hücrelerinden elde edilen GHRH proteini hedef olarak kullanılarak, manyetik boncuk teknolojisi yardımıyla x-aptamer seçilimi gerçekleştirilmiş ve 19 adet putatif x-aptamer elde edilmiştir. Elde edilen x-aptamerlerin rekombinant GHRH proteinine bağlanma afiniteleri Dot blot yöntemi ile araştırılmış ve aptamer uygulaması ile proteine bağlanma afinitesinin 1,5 ila 4 kata kadar arttığı belirlenmiştir. Ayrıca aptamer dozuna bağlı gerçekleştirilen Dot blot yöntemi sonucunda non-lineer regresyon analizi yapılarak aptamerlerin disosiasyon sabiti (Kd) değerleri hesaplanmıştır. TKY2.T1.13 aptameri ile gerçekleştirilen SPR analizi sonucunda bu aptamer için Kd değeri 47,5 nM olarak tespit edilmiş ve non-lineer regresyon analizi ile elde edilen 57,5 nM Kd değerine yakın bir değer olarak gösterilmiştir. Aptamerler süreye bağlı olarak insan serumu ile muamele edilerek aptamerlerin serum stabiliteleri araştırılmış ve aptamerlerin çoğunlukla 72 saate kadar insan serumunda %50'nin üzerinde stabil kaldığı belirlenmiştir. TKY2.T1.08 ve TKY2.T1.13 aptamerlerinin hücre içerisinde yer alan endojen GHRH'ye doza bağlı olarak artan bağlanma afinitesi MIA PaCa-2 hücrelerinde immunofloresan yöntemi ile gösterilmiştir. Putatif x-aptamerlerin GHRH sinyal yolağına etkisinin araştırılması için aşağı yolak elemanları olan GH ve GHRH-R ekspresyonuna etkileri immunofloresan yöntemi ile gösterilmiş ve aptamer uygulaması ile bu proteinlerin ekspresyonlarındaki azalma gösterilmiştir. Ayrıca, TKY2.T1.08 ve TKY2.T1.13 x-aptamerlerinin MIA PaCa-2 pankreas, HT29 kolorektal ve PC3 prostat kanseri hücrelerinde hücre canlılığına ket vurduğu ve mitokondriyal membran potansiyelini düşürdüğü belirlenmiştir. Putatif x-aptamerlerin hücre döngüsü üzerine etkileri araştırıldığında ise TKY2.T1.13 aptamerinin MIA PaCa-2, HT29 ve PC3 hücrelerinde SubG1 populasyonunu arttırdığı, TKY2.T1.08 aptamerinin ise HT29 ve PC3 hücrelerinde G2/M populasyonunu arttırdığı gösterilmiştir. Putatif x-aptamerlerin hücre ölümü üzerine etkileri Annexin V/PI hücre akış sitometrisi yöntemi ile araştırılmış ve TKY2.T1.13 x-aptamerinin MIA PaCa-2, HT29 ve PC3 hücrelerinde geç apoptotik hücre populasyonunda artışa neden olduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak, bu tez çalışması kapsamında GHRH (1-44) proteinine özgü x-aptamer sentezi ilk kez gerçekleştirilmiş, sentezlenen x-aptamerlerin hedef proteine bağlanma afiniteleri gösterilmiş ve GHRH sinyal yolağına ket vurarak antikarsinojenik etkileri MIA PaCa-2, HT29 ve PC3 hücrelerinde gösterilmiştir.
  • Thumbnail Image
    PublicationOpen Access
    Epibrassinolidin kanser hücrelerinde interaksiyon partnerlerinin in silico araştırılması ve bu partnerlerle ilişkili hücre ölüm mekanizmalarının in vitro incelenmesi
    (İstanbul Kültür Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı, 2021) Mehdizadehtapeh, Leila; Yerlikaya, Pınar Obakan; Tok, Tuğba Taşkın
    Kanser biyolojisinin moleküler temeli ve gelişim risk faktörlerine yönelik araştırmalar kanserin tanı ve prognozu hakkında genetik, epigenetik ve hücresel boyutlarda aydınlatıcı ilerlemeler sağlamaktadır. Bu durum geliştirilen terapötik stratejilern hedefe yönelik odaklanmasına ve kişiye özel alternatif ve etkin ajanların ortaya çıkmasına fırsat tanımaktadır. Diyet kaynaklarından ve bitkilerden elde edilen çeşitli özütler ve küçük sentetik analoglarının DNA onarımı, hücre döngüsü modülasyonu, protein katlanması ve sentezi, apoptoz, anti-inflamatuar aktiviteler gibi önemli hücresel ve moleküler mekanizmalara dahil oldukları bilinmektedir. Bu araştırmada, epibrassinolidin kanser hücrelerinde interaksiyon partnerlerinin in siliko araştırılması ve bu partnerlerle ilişkili hücre ölüm mekanizmalarının in vitro incelenmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda, ilk olarak, bitki metabolizması ve stres yönetiminin aktif steroid fitohormonu olan 24- Epibrassinolidin (EBR),tümör biyolojisi ile ilişkili seçili otuzbeş fonksiyonel hedef proteinine karşı, in siliko reseptör-ligand moleküler kenetlenme yaklaşımı ile skorlama fonksiyonları hesaplanmıştır. AutoDock Tools-1.5.7 yazılımı ile yürütülen analizler sonucunda, EBR ligandı için retinoik asit nükleer reseptör RARγ hedefinin -14.78 kcal/mol bağlanma enerjisi (BE) ile en kararlı interaksiyon partneri olarak belirlenmiştir. Ayrıca, RARγ ve altı selektif agonisti bileşikle ikinci raund simülasyon analizleri en düşük BE skorunu EBR için belirlemiştir. Kompütasyonel verilerin doğrulanması ve EBR'nin hücre içi biyolojik süreçlerdeki moleküler hedeflerinin tanımlanması amacıyla, hücre canlılığı, sitotoksisite, koloni oluşumu ve hücre ölüm mekanizmalarının aktivasyonu ile bağlantılı in vitro moleküler analizler tasarlanmıştır. Üç farklı kanser tiplerine ait MDA-MB-231 meme, MİApaca-2 pankreas ve HEP-G2 hepatöselüler karsinoma doğal tip hücre soylarında, doza ve zamana bağlı EBR uygulanma sonrasında nükleer hormon reseptör (NHR) anlatımları, apoptotik, ER stres ve Hipp-YAP/TAZ sinyalizasyonları ile ilişkili etkileri incelenmiştir. Elde edilen bulgular, EBR uygulamanın doza ve zamana bağlı NHR, ER stres ve hippo aktivatör markerlerin çoğunda anlamlı ifade değişikliliğine yol açtığını, özellikle ER stres aracılı esansiyel biyobelirteçlerinin proteomik profil değişimine doğrudan bağlantılı olarak mitokondriyel hücre ölümünü teşvik ettiğini göstermiştir. Özetle, bu araştırmada, 24-epibrassinolidin hormon reseptör duyarlı/duyarsız tümör hücrelerindeki proliferasyon, ER stres yönetimi ve metastaz üzerinde ket vurucu etkileri ile alternatif terapötik stratejilerin geliştirilmesinde umut verici potansiyeli taşıdığı sonucuna varılmıştır.