Berrak Hücreli Renal Hücreli Karsinomada Yağ Asit Metabolizması İlişkili AMPK ve miR-33a İfadelerinin Klinikopatolojik Parametrelerle İlişkisinin TCGA Veri Setinde ve Hücre Hatlarında Moleküler Düzeyde Analizi

Abstract

Böbrek kaynaklı en sık izlenen kanser olan ve lipid metabolizması ile yakından ilişkili olduğu gösterilen berrak hücreli renal hücreli karsinom (BHRHK)' da yağ asidi metabolizmasının rolü, günümüzde prognozu tahmin etmek ve tedavi stratejilerini yönlendirebilmek amacıyla çok sayıda araştırmaya konu olmuş ve yeterli düzeyde kanıtlara ulaşmak için halen yeni çalışmalara konu olmaya devam etmektedir. Bu çalışmada, Kanser Genom Atlası (The Cancer Genome Atlas, TCGA) veri bankası üzerinden, yağ asit metabolizması ile ilişkili olan 5′-adenozin monofosfat (AMP) ile aktive edilmiş protein kinaz (AMPK) ve yağ asidi metabolizması ile ilişkisi en net açıklanan mikro RNA olan miR-33a ifadelerinin BHRHK olgularında klinikopatolojik verilerle ilişkisini araştırdık. Ardından, hücre hattı analizleriyle, AMPK ve miR-33a ifadelerinin primer ve metastatik BHRHK hücre hatlarında hücresel düzeyde ifadelerini ve miR-33a modulasyonlarının hücre içi lipid birikimi üzerine etkilerini değerlendirdik. TCGA veri bankasında kayıtlı BHRHK olgularına ait biyoinformatik veriler açık erişimli cBioPortal, UCSC Xena, UALCAN ve Linkedomics veri portalları kullanılarak elde edildi. Bu portallardaki yerleşik istatiksel metodlar ile AMPK 1 ve 2 genleri mRNA ifadeleri ile miR-33a ifade seviyelerinin BHRHK olgularında patolojik tümör derecesi, patolojik tümör T evresi, N evresi ve M evresi, ve sağkalım gibi klinikopatolojik parametrelerle olan ilişkileri irdelendi. Ayrıca, miR-33a ve AMPK1 ve 2 ifadeleri arasındaki korelasyonlar da analiz edildi. Takiben, primer BHRHK kaynaklı A-498 ve metastatik BHRHK kaynaklı Caki-1 hücre hatları ve kontrol hücre hattı olarak kullanılan HEK-293 hücre hatlarında immunoblotlama ile AMPK 1α alt ünitesi protein seviyeleri ve kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR, qRT-PCR) ile miR-33a ifadeleri belirlendi. Son aşamada ise, miR-33a mimik ve anti-miR-33a trasnfeksiyonları sonrası miR-33a modülasyonlarının bu hücre hatlarında hücre içi lipid birikimleri üzerine etkileri BODIPY ve eş zamanlı DAPI floresan boyama yöntemiyle değerlendirildi. TCGA analiz sonuçlarına göre; BHRHK olgularında primer tümör dokularında AMPK 1 ve 2 mRNA ifadelerinin normal doku örneklerine kıyasla büyük oranda anlamlı azalma sergiledikleri izlendi. Tümör patolojik derecesi ve T evresi ilerledikçe bu azalmalar daha da belirginleşme eğilimindeydi. Benzer şekilde lenf nodu tutulumu ve metastazlı olgularda da anlamlı derecede daha az ifade edildikleri gözlendi. Ayrıca, azalmış AMPK 1 ve 2 mRNA ifadelerinin BHRHK olgularında daha kötü sağ kalım sonuçları ile ilişkili olduğu saptandı. Protein düzeyinde ise primer tümörlü dokularda AMPK 1 protein ifadesinin normal dokulara oranla anlamlı derecede yüksek, AMPK 2 protein ifadesinin ise anlamlı derecede düşük olduğu belirlendi. Artmış AMPK 1 protein ifadesi artan tümör T evresi ile birlikte daha da artma eğilimindeydi. miR33-a ifadeleri irdelendiğinde primer tümör dokularında normal doku örneklerine kıyasla anlamlı derecede azalmış miR-33a ifadesi izlenirken, BHRHK' ya ait primer tümör doku örneklerinde T evresi ilerledikçe miR-33a ifadesinin artma eğiliminde olduğu belirlendi. Bu dokularda, ayrıca, miR-33a ile AMPK 1 ve 2 mRNA ifadeleri arasındaki negatif yönde zayıf korelasyonların olduğu saptandı. Ancak, alt grup analizlerinde bu korelasyonların yüksek T evreli olgularda olmadığı belirlendi. Hücre hatları analizlerimizde ise; AMPK 1α protein ve miR-33a ifade düzeylerinin, daha agresif olan metastatik Caki-1 hücrelerinde A-498 primer tümör hücrelerine oranla anlamlı derecede daha yüksek olduğu belirlendi. miR-33a mimik transfeksiyonlarına bağlı olarak hücre içi lipid içeriğinde belirgin değişim olmadığı gözlemlenirken, anti-miR-33a transfeksiyonlarının A-498 ve Caki-1 hücrelerinde hücre içi doğal lipid oranında azalmaya sebep olduğu izlendi. Öte yandan, hücre içi lipid düzeyindeki azalma AMPK 1α protein seviyesi daha yüksek olan metastatik Caki-1 hücrelerinde daha fazlaydı. Bulgularımız, BHRHK patogenezinde yağ asit metabolizması ilişkili AMPK ve miR-33a' nın erken evre ve ileri evre hastalıkda farklı karmaşık rollleri olabileceğini düşündürecek kanıtlar olarak ele alınabilir. Hücre hatlarından elde ettiğimiz sonuçlara göre, AMPK 1α protein seviyesi daha yüksek olan metastatik hücrelerde anti-miR-33a ile müdahelenin hücre içi lipid birikimini önemli ölçüde azalttığı saptandı. Sonuç olarak bulgularımız, miR-33a' nın ileri evre BHRHK tedavisinde potansiyel bir hedef olabileceğini desteklemekle birlikte, bu konuda daha net sonuçlar için miR-33a' nın hücre sağkalımı üzerine etkilerinin de ayrıntı irdelenmesi gerekmektedir.