Kimyasal Yeniden Programlama Ajanının Arabidopsis Thaliana'nın Somatik Embriyogenezi Üzerindeki Moleküler Etkileri

Abstract

Çok hücreli organizmalarda hücre kaderinin belirlenmesi, gen anlatımının epigenetik düzeyde hassas bir biçimde düzenlenmesiyle sağlanır. Bu süreçlerin önemli örneklerinden biri olan somatik embriyogenez, farklılaşmış hücrelerin yeniden programlanarak embriyo benzeri yapılara dönüşmesini ifade eder. Bu olay, bitkilerin gelişimsel yeniden programlanabilirliğinin en çarpıcı örneklerinden biri olup, hayvansal sistemlerdeki hücresel yeniden programlama ve pluripotensi oluşum süreçleriyle yüksek düzeyde benzerlik göstermektedir. Her iki sistemde de epigenetik düzenlemeler (DNA metilasyonu, histon modifikasyonları ve kromatin yeniden yapılanması) hücre kimliğinin yeniden tanımlanmasında kritik rol oynar. Histon metilasyonunun düzenlenmesi, somatik embriyogenez sürecinde hücresel yeniden programlamanın epigenetik kontrolünde önemli bir mekanizma olarak öne çıkmaktadır. Son yıllarda yapılan araştırmalar, histon metiltransferaz inhibitörlerinin bu süreci yönlendirmede etkili olabileceğini ortaya koymuştur. Özellikle BIX-01294 inhibitörünün, farklı bitki türlerinde H3K9me2 düzeyini azaltarak embriyogenez sürecini teşvik ettiği gösterilmiştir. Bu etkinin, H3K9'un ikinci dereceden metillenmesini katalizleyen histon lizin metiltransferaz (SUVH) enzimlerinin inhibisyonu yoluyla gerçekleştiği düşünülmektedir. Bitkilerde çeşitli histon lizin metiltransferaz (HKMT) aileleri tanımlanmış olup, bu enzimlerin büyük çoğunluğu, hayvanlar ve mayalarda bulunan SET domaini ile yapısal ve işlevsel homoloji göstermektedir. Bu durum, epigenetik mekanizmaların canlılar arasında büyük ölçüde korunmuş olduğunu ve hücresel yeniden programlamanın temelinde benzer moleküler yolların yer aldığını göstermektedir. Kök ve kanser hücreleri gibi çok hücreli sistemlerde yeniden programlama ajanı olarak tanımlanan diazepin-kinazolin-amin türevi BIX-01294'ün, bitki hücrelerinde somatik embriyogenez sürecini tetikleyip embriyo gelişimini destekleyen epigenetik mekanizmalar üzerindeki potansiyel etkileri bu tez kapsamında incelenmiştir. Bu doğrultuda, farklı konsantrasyonlar (0,1; 0,05; 0,5; 1 ve 2,5 µM) BIX-01294 ve somatik embriyogenezi teşvik eden 5 µM 2,4-D (oksin) içeren kültür ortamlarında, olgunlaşmamış zigotik embriyolardan somatik embriyogenez elde edilmesi hedeflenmiştir. HKMT inhibitörünün farklı konsantrasyonlarda kültür ortamına eklenmesiyle gerçekleştirilen denemeler sonucunda, 0,1 μM'lik konsantrasyonun embriyogenez indüksiyonu için yeterli olduğu saptanmıştır. 21. gün sonunda, 2,5 μM BIX-01294 veya oksin varlığında olgunlaşmamış zigotik embriyolardan oluşan SE sayısı sırasıyla %35,41 ve %31,25 olarak belirlenmiştir. Bulgularımız, BIX-01294'ün 2,4-D'ye kıyasla bükülmüş kotiledon evresindeki olgunlaşmamış zigotik embriyolarda 1,13 kat SE oluşumunu artırdığını göstermiştir. Ayrıca bir eksplant üzerinde oluşan somatik embriyo sayısı 5 µM 2,4-D'ye kıyasla 2,5 µM BIX-01294'te 3,95 kat artmıştır. Yaptığımız transkriptomik çalışma sonucunda diferansiyel gen anlatım analizi (DEG) incelendiğinde, 10. gün kontrol grubuna kıyasla 10. gün, 5 µM 2,4-D uygulamasında SUVH3 (AT1G73100) (2,49 kat), SUVH5 (AT2G35160) (2,36 kat), SUVR2 (AT5G43990) (2,34 kat) ve SUVR5 (AT2G23740) (2,21 kat) olmak üzere histon lizin metiltransferaz transkriptlerinin anlamlı düzeyde arttığı saptanmıştır. Buna karşılık 10.gün kontrole kıyasla 2,5 µM BIX-01294 histon lizin metiltransferaz inhibitörünün uygulandığı grupta bu transkriptlerin anlamlı bir değişikliğe sahip olmadığı belirlenmiştir. Bu durum, BIX-01294'ün HKMT enzimlerinin aktivitesini inhibe ettiğinin ve epigenetik yeniden programlama sürecinde somatik embriyogenez üzerinde teşvik edici bir etki yarattığını düşündürmektedir. Bulgularımız, BIX-01294 ve 2,4-D'nin somatik embriyogenez sürecinde rol oynayan ana düzenleyici transkripsiyon faktörlerini (LEC1, AGL15, FUS3, PHV, PHB, PLT, AIL7) benzer şekilde tetiklediğini ortaya koymuştur. SE'nin 5 µM 2,4-D ile indüksiyonunda özellikle oksin sinyal genleri (YUCCA, IAA, ARF) aktif olarak rol oynarken, 2,5 µM BIX-01294'te ise WRI1-aracılı yolak, SE sürecinin indüksiyonunda en olası aday mekanizma olarak öne çıkmıştır. Bu sonuçlar, BIX-01294'ün hücresel yeniden programlamada önemli bir düzenleyici rol oynadığını göstermektedir. Çok hücreli sistemlerde kimyasal yeniden programlama ajanı olan BIX-01294'ün ilk kez model bir bitki olan Arabidopsis thaliana' da kullanılmıştır. Bu tez çalışmasından elde edilen bulgular, hücrelerin yeniden programlanması için gerekli moleküler ve hücresel mekanizmaların anlaşılmasına katkı sağlayabilir. Hücreyi embriyoya dönüştüren yeniden programlama yollarının daha derinlemesine anlaşılması, bitki mikroçoğaltımını ve yeşil biyoteknoloji uygulamalarını geliştirmemize yardımcı olacaktır.